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| 品牌 | SOLARBIO/索萊寶 | CAS | 詳詢 |
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| 分子式 | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
| 分子量 | 詳詢 | 貨號 | BC5385 |
| 規格 | 100T/48S | 供貨周期 | 現貨 |
| 主要用途 | 吡咯啉-5-羧酸還原酶活性檢測 | 應用領域 | 環保,化工,生物產業,農林牧漁,綜合 |
吡咯啉-5-羧酸還原酶（P5CR）活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC5385
規格：100T/48S
產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液體600μL×1支 | -20℃保存 |
試劑一 | 液體5mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體10mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑四 | 液體4mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、 提取液二：易揮發試劑，用完及時擰蓋封口放回-20℃。
2、 提取液的配制：根據樣本量按提取液一：提取液二=0.99mL：0.01mL（1T）的比例配制提取液，現用現配，禁止提前配制。
3、 試劑三：臨用前取一支試劑三加入5.6mL試劑一，充分混勻。未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復凍融。
4、 標準品：臨用前加入 1.4 mL 蒸餾水，即 2 µmol/mL NADH標準液。未用完的試劑分裝保存，-20℃可以保存2周，避免反復凍融。臨用前取100μL的2 µmol/mL NADH標準液于EP管中，加入700μL蒸餾水充分溶解，配制成0.25μmol/mL的NADH標準液。現用現配。
產品說明：
吡咯啉-5-羧酸還原酶(pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR)是廣泛存在于原核和真核生物中的一種重要的管家蛋白。在NAD(P)H的作用下，吡咯啉-5-羧酸(P5C)在吡咯啉-5-羧酸還原酶作用下轉化為脯*酸，并且P5CR 還被發現能夠在大腸桿菌中參與到硫代脯*酸 (Thioproline) 的代謝過程。
硫代脯*酸在吡咯啉-5-羧酸還原酶催化作用下脫氫，并伴隨著NAD轉化為NADH。在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH 反應，產生水溶性formazan，在450nm下有特征吸收峰
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋/恒溫培養箱、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、蒸餾水和冰。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
3、血清（漿）等液體：直接測定。(若溶液呈現渾濁，則離心取上清后再測定)。
二、測定步驟
1、 可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節波長至450nm，可見分光光度計用蒸餾水調零。
2、操作表：
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 |
試劑二 | 90 | 90 | 90 | 90 |
試劑三 | 90 | - | - | - |
蒸餾水 | - | 90 | 90 | 110 |
試劑四 | 20 | 20 | 20 | 20 |
標準品 | - | - | 20 | |
樣品 | 20 | 20 | - | - |
充分混勻，37℃反應顯色30min，取200μL于微量玻璃比色皿或96孔板中，測定在450nm處的吸光度。記作A測定，A對照，A標準，A空白。ΔA測定=A測定-A對照，ΔA標準=A標準-A空白。（標準管和空白管只需做1-2次。）
三、P5CR活性計算
(1) 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
P5CR活性（U/mg prot）=(ΔA測定×C標準÷ΔA標準) ×V樣÷（Cpr×V樣）÷T×103×F=8.333×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr×F
(2) 按樣本質量計算
單位的定義：每g組織每分鐘催化產生1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
P5CR活性（U/g 質量）= (ΔA測定×C標準÷ΔA標準) ×V樣÷（W÷V樣總×V樣）÷T×103×F=8.333×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F
(3) 按細菌或細胞數目計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
P5CR活性（U/104 cell）= (ΔA測定×C標準÷ΔA標準) ×V樣÷（500÷V樣總×V樣）÷T×103×F=0.0167×ΔA測定÷ΔA標準×F
(4) 按血清（漿）等液體體積計算
單位的定義：每mL血清（漿）等液體每分鐘催化產生1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
P5CR活性（U/mL）= (ΔA測定×C標準÷ΔA標準) ×V樣÷V樣÷T×103×F=8.333×ΔA測定÷ΔA標準×F
C標準: NADH標準液的濃度，0.25μmol/mL；V樣：反應體系中加入的樣本體積，0.02mL；V樣總：加入的提取液體積，1mL；T：反應時間，30min；Cpr：蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌數目，500萬；103：單位換算系數，1μmol/mL=103nmol/mL；F：樣本稀釋倍數。
注意事項：
1. 如果A測定大于1.8或者?A測定大于1，可以減少樣品量或者縮短反應時間；若?A測定小于0.01，可以加大樣品量或者延長反應時間至1h或者更長時間。計算公式注意同步修改
實驗實例：
1、 稱取0.0993g橙子葉，加入提取液進行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA測定=A測定-A對照=0.318-0.288=0.03，ΔA標準=A標準-A空白=0.538-0.181=0.357，帶入公式計算：
P5CR活性(U/g 質量)= 8.333×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F =8.333×0.03÷0.357÷0.0993=7.052 U/g 質量
2、 稱取0.1006g小鼠腎臟組織，加入提取液進行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA測定=A測定-A對照=0.369-0.274=0.095，ΔA標準=A標準-A空白=0.538-0.181=0.357，帶入公式計算：
P5CR活性(U/g 質量)= 8.333×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F =8.333×0.095÷0.357÷1.006=22.042 U/g 質量
3、 吸取0.02mL羊血清，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA測定=A測定-A對照=0.299-0.146=0.153，ΔA標準=A標準-A空白=0.538-0.181=0.357，帶入公式計算：
P5CR活性(U/mL)= 8.333×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F =8.333×0.153÷0.357=3.571 U/mL
參考文獻：
FENG Chang-Z, XIE Y H, CAO Y, et al. Expression, Purification and Physicochemical Characteristics of Pyrroline-5-Carboxylic Acid Reductase in Drosophila[J]. Chinese Journal of Biological Engineering, 2012, 32(6):8.
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