NAD-蘋果酸酶（NAD-ME）活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號: BC1135
規格: 100T/96S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入10 mL提取液充分溶解備用；

2. 試劑三：臨用前每支加1 mL雙蒸水充分溶解備用；

3. 試劑四：用時每支加500 μL雙蒸水充分溶解備用；

4. 工作液：在7.5 mL試劑二中加入1 mL試劑三和0.5 mL試劑四，可以根據比例現用現配。

產品說明：
ME廣泛存在于微生物、培養細胞、動物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高。ME催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應，產生丙 酮酸和CO₂，以及伴隨NAD(P)⁺的還原反應，是蘋果酸代謝的關鍵酶。ME活性與生物合成和抗氧化密切相關。近年來植物ME活性測定較多，已經成為抗氧化研究的熱點。根據輔酶專一性和對底物特異性的不同，可將ME分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
NAD-ME催化NAD⁺還原成NADH，在340nm下測定NADH增加速率。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標儀、低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽/勻漿器、蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產品資料"附件
注意事項：

1. 若A2-A1大于0.5，需將樣本用提取液稀釋，使A2-A1小于0.5，可提高檢測靈敏度。

2. 實驗時，樣本在冰上放置，以免變性和失活。試劑一37℃或25℃水浴放置。

3. 比色皿中反應液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應過程中把比色皿連同反應液放在此燒杯中。用96孔板做時盡量保持反應溫度在37℃或25℃。

4. 最好兩個人同時做此實驗，一個人比色，一個人計時，以保證實驗結果的準確性。用96孔板做時盡量做到樣本反應時間一致。

5. 如果ΔA＜0.01，可將反應時間延長到10分鐘。

實驗實例：

1. 取0.1g肝加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清，按照測定步驟操作，使用微量石英比色皿測得計算ΔA=A2-A1=0.893-0.6814=0.2116，按樣本質量計算酶活得：

NAD-ME（U/g 質量）=965×ΔA÷W=965×0.2116÷0.1=2041.94 U/g 質量。
參考文獻：

1. Spampinato C P, Colombo S L, Andreo C S. Interaction of analogues of substrate with NADP-malic enzyme from maize leaves[J]. Photosynthesis research, 1994, 39(1): 67-73.

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