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| 品牌 | SOLARBIO/索萊寶 | CAS | 詳詢 |
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| 分子式 | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
| 分子量 | 詳詢 | 貨號 | BC3400 |
| 規格 | 50T/48S | 供貨周期 | 現貨 |
| 主要用途 | 焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉移酶(PFP)檢測 | 應用領域 | 環保,化工,生物產業,農林牧漁,綜合 |
紫外分光光度法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC3400
規格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體55 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體40 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑四 | 液體×2支 | 2-8℃保存 |
試劑五 | 液體×2支 | -20℃保存 |
試劑六 | 液體60 μL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前加6 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存兩周，禁止反復凍融。
2、 試劑三：臨用前加6 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存兩周，禁止反復凍融。
3、 試劑四：臨用前取1支加入0.3 mL蒸餾水溶解備用，2-8℃保存一周。
4、 試劑五：臨用前取1支加入0.3 mL蒸餾水溶解備用，-20℃分裝保存一周，禁止反復凍融。
5、 試劑六：臨用前加入0.6 mL蒸餾水溶解備用，2-8℃保存一周，也可按比例現用現配。
產品說明：
焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸轉移酶（PFP，EC2.7.1.90）是一種胞質酶，廣泛存在于植物組織中，與磷酸果糖激酶一樣催化果糖-6-磷酸的磷酸化，單PEP催化反應為可逆反應，并以焦磷酸代替ATP，在光合作用碳代謝中起重要作用。
PFP催化6-磷酸果糖轉化為1,6-二磷酸果糖，它在醛縮酶和磷酸丙糖異構酶的作用下轉變為磷酸二羥丙 酮，再由α-磷酸甘油脫氫酶和NADH 催化生成3-二磷酸甘油和NAD，340nm處的吸光度變化反映了PFP的活性的高低。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、1 mL石英比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP管。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、組織：按照質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1 g，加入1 mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，20000 g離心15 min，取上清置冰上待測；
2、細胞：按照細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1 mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300 W，超聲3 s，間隔7 s，總時間3 min）；然后4℃，20000 g離心15 min，取上清置冰上待測；
3、液體：直接檢測。
二、測定步驟
1、 分光光度計預熱30 min以上，調節波長至340 nm，蒸餾水調零。
2、 操作表：
試劑名稱（μL） | 測定管 | 空白管 |
試劑一 | 670 | 670 |
試劑二 | 100 | 100 |
試劑三 | 100 | 100 |
試劑四 | 10 | 10 |
試劑五 | 10 | 10 |
試劑六 | 10 | 10 |
樣本 | 100 | - |
蒸餾水 | - | 100 |
充分混勻于1 mL石英比色皿中測定37℃條件下，340 nm處初始值A1和30 min的吸光值A2，分別記為A1測定管、A1空白管、A2測定管，A2空白管。計算 ΔA= （A1測定管-A2測定管）-（A1空白管-A2空白管）。 注：也可將試劑一、二、三、四、五、六按操作表比例，配制成工作液，現配現用；空白管只需做1-2次。 | ||
三、焦磷酸：果糖6-磷酸-1磷酸轉移酶活性的計算
（1）按照樣本蛋白濃度計算
酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PFP（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(V樣×Cpr) ÷T=53.59×ΔA÷Cpr
（2）按照樣本質量計算
酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PFP（U/g 質量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(W×V樣÷V提取) ÷T=53.59×ΔA÷W
（3）按照細胞數量計算
酶活單位定義：每104個細胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PFP（U/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(V樣×細胞數量÷V提取) ÷T=53.59×ΔA÷細胞數量
（4）按照液體體積計算
酶活單位定義：每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
PFP（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷V樣÷T=53.59×ΔA
V反總：反應體系總體積，0.001 L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1 cm；V樣：加入樣本體積，0.1 mL；V提?。杭尤胩崛∫后w積，1 mL；T：反應時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；109：換算系數，1mol=109 nmol。
注意事項：
1、每次檢測樣本數不宜太多以免耽誤過多的酶促反應時間。
實驗實例：
1、取0.1g豆芽進行樣本處理，取上清后按照測定步驟操作，測得計算 A1測定管-A2測定管=1.041-0.963=0.078、A1空白管-A2空白管=0、ΔA=（A1測定管-A2測定管）-（A1空白管-A2空白管）=0.078，按照樣本質量計算酶活得：
PFP（U/g 質量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(W ×V樣÷V提取) ÷T=53.59×ΔA÷W=41.8 U/g 質量。
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