NADPH-細*色素C還原酶（NCR）活性檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC2720

規格：50T/48S

產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前取一瓶加入50mL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑2-8℃保存可保存4周；

2、 試劑三：臨用前取一瓶加入1.3mL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融。

3、 試劑四：臨用前取一支加入275μL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融。

產品說明：

細胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。NCR作為P450酶系的重要一員，催化氧化型P450還原再生。

NCR催化NADPH還原氧化型細*色素C，還原型細*色素C在550nm處有特征吸收峰；通過測定550nm吸光度的增加速率，來計算NCR活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、恒溫培養箱/水浴鍋、低溫離心機、超速離心機、研缽/勻漿器、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、除去細胞核和線粒體等：稱約0.5g組織，加入4℃預冷的1mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g，4℃離心30min，取上清液，轉移到超速離心管中。

2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。

4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加0.5mL試劑二，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，置于冰上待測。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計預熱30min以上，調節波長至550nm，蒸餾水調零。

2、 臨用前根據實驗用量取出部分試劑二在37℃水浴中預熱30min。

3、空白管：取1mL玻璃比色皿，依次加入50μL蒸餾水、900μL試劑二、50μL試劑三和10μL試劑四，迅速混勻后于550nm處測定2min內吸光值變化，測定第10s和第130s吸光值，分別記為A1、A2。計算ΔA空白=A2-A1。空白管只需做1-2次。

4、測定管：取1mL玻璃比色皿，依次加入50μL粗酶液、900μL試劑二、50μL試劑三和10μL試劑四，迅速混勻后于550nm處測定2min內吸光值變化，測定第10s和第130s吸光值，分別記為A3、A4。計算ΔA測定=A4-A3。

三、NCR活性計算

1、按蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃條件下，每毫克蛋白每分鐘催化產生1μmol還原型細*色素C為1個酶活單位。

NCR (U/mg prot)= (ΔA測定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反總÷（Cpr×V樣）÷T

= 0.529×(ΔA測定-ΔA空白)÷Cpr

2、按樣本質量計算

活性單位定義：37℃條件下，每克組織每分鐘催化產生1μmol還原型細*色素C為1個酶活單位。

NCR (U/g 質量)= (ΔA測定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T

=0.265×(ΔA測定-ΔA空白)÷W

ε：還原型細*色素C摩爾消光系數，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積，1010μL=0.00101L；Cpr：粗酶液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定；V樣：加入反應體系中粗酶液體積，50μL=0.05mL；V樣總：樣本處理中最后加入試劑二體積，0.5mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，2min。

注意事項：

1、如果測定吸光值A＞1.2或ΔA＞0.8，建議稀釋樣本后再測定，計算公式中乘以稀釋倍數。

2、如果測定吸光值較低或接近空白OD值，建議增加樣本量后再進行測定，注意同步修改計算公式。

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